干貨 | 日本注射劑滅菌工藝選擇思路簡介
引言：我們在進行注射劑一致性評價研究中，往往會發現參比制劑采用了濕熱滅菌工藝，但該濕熱工藝條件有顯然又達不到F0>8。特別是一些來源于日本的注射劑，甚至于大輸液的產品，都采用的是F0<8的滅菌工藝，這是怎么回事呢？查閱日本厚生省發布的《通過最終滅菌方法生產無菌藥物的準則》（下文簡稱日本的無菌指南），探究一下日本對于滅菌工藝選擇的要求。
雖然沒有像歐盟一樣畫出滅菌選擇決策樹，但是日本在對滅菌工藝選擇上的邏輯仍是基本一致的。那就是首選121℃，15min的濕熱滅菌條件，次選F0>8的滅菌條件，如果產品不能耐熱，再選擇其他F0<8的其他熱處理工藝。與歐盟無菌指南不同的是，日本對于F0<8的濕熱工序選擇有更加詳盡的描述。
在日本無菌指南的附錄——滅菌條件設計法中，提出可以選擇A/B/C/D四種方法中的任何一種，保證產品的無菌。
A、半周期法；B、過度殺滅法；C、生物指示劑和微生物負載結合法；D、絕對微生物負載法。
A：半周期法
不知道為什么叫這個名字，從做法來看似乎應該叫雙周期法更合適。這種方法是在滅菌柜冷點的位置放置了初始細菌計數為106?CFU的生物指示劑，其滅菌時間是所有生物指示劑死亡時間的兩倍。在過度殺滅法中，滅菌時間為12min，而在半周期法中，滅菌時間為14min至16min。初始細菌計數為106?CFU的生物指示劑的存活概率在7 min時為10％，在8 min時為1％，因此（7 min至8min）× 2=14min至16min。與過度殺滅法相比，半周期法的時間會更長。歐盟藥典推薦的滅菌條件為121℃，15min，其實按日本的話說就是半周期法。歐盟無菌指南提到采用121℃，15min的滅菌條件的產品申報時可以不提交滅菌驗證資料，理由應該就是半周期法對無菌保證有著極高的保險系數。
B：過度殺滅法
就是大家耳熟能詳的F0>12的滅菌條件，不再贅述。
C：生物指示劑和微生物負載結合法
簡而言之，這種方法適合于不能終端滅菌，但還是能夠耐受相對較高的F0值的產品。每批產品生產時，對滅菌前產品的耐熱菌種進行鑒定，并在滅菌操作時加入預設的生物指示劑。生物指示劑的D值應高于每批產品經鑒定的耐熱菌的D值。
這種方法基于生物指示劑的D值高于從菌種鑒定試驗中獲得的耐熱細菌的D值的前提，并且滅菌時間通常根據以下公式設置：
滅菌時間 = D × log No / N
?? D：生物指示劑的D121值
?? No：微生物允許殘存的概率（10-6）
?? N：細菌初始數量
這里的細菌初始數量是最大微生物負載加上標準偏差的3倍，即打出1 或2 個lg值的富余量。過度殺滅法的F0值能達到12以上，而生物指示劑和微生物負載結合法通常具有F0值在6至7。
例如，假設對某產品污染菌的情況進行了調查，細菌的初始數量（估計值）為102cfu，通過篩選獲得的最強耐熱菌的D值為0.2分鐘。那么，可以在實際滅菌工作中選擇更高D值的生物指示劑（D121=0.5），要達到10-6的殺滅目標則需要減少4 個lg值，則微生物F0值為F0?BIO?= 4×D121?= 4×0.5 = 2.0。即該產品采用F0值=2的滅菌工藝即可達到實際微生物殘存概率法<10-6的效果。
此外，生物指示劑和微生物負載結合法，有必要進行每日微生物監控，并不斷確認微生物負載的量和耐熱菌的耐熱性。
D：絕對微生物負載法
比起上述生物指示劑和微生物負載結合法，絕對微生物負載法適合于對熱更加不穩定的品種。思路與前者類似，但不再使用D值更高的生物指示劑，而是直接使用產品中的最強耐熱菌的D值來確定滅菌工藝的目標F0值
假設下圖是某產品D值與溫度之間的關系。
圖 某產品D值與溫度之間的關系圖
從上圖可以看出，耐熱細菌的D121值為D121?= 10-0.1×121+11.5= 0.25（分鐘），耐熱細菌為從106減小到10-6所需的F0值可以通過以下公式計算：
F0 = D121?×（lgA－lgB）
將A =106，B =10-6，D121?= 0.25代入該式，得出F0 = 0.25×（6 + 6）= 3.0。
此處獲得的F0 =3.0是設定滅菌條件的目標值，可依此選擇滅菌條件并進行相應滅菌驗證。實際上，在受控的生產設施中觀察到的微生物負載實際上遠少于106cfu，例如，如果最大微生物負載被證明為102cfu，則微生物殺滅數從102減少到10-6個。要求的最小F0值為0.25×（2 + 6）= 2.0，要求F0≥2.0即可確保無菌。
當然，在實際操作中，尚需考慮增加設定檢測回收率等的安全系數，目標F0值不宜太低。
絕對微生物負載法，更加有必要進行連續并且頻繁的微生物調查，如發現出現了更強的耐熱菌，則需要評估對產品的影響。?
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總結：
綜上，日本無菌指南最大的特點是對F0值<8的熱處理工藝的選擇進行了詳細的講解。這可能是日本的注射劑產品很多都采用這種終端熱處理的原因所在。其實歐盟2019版的無菌指南對熱處理的很多要求和日本是一致的。如其指出：“在滅菌工藝驗證中的 SAL取決于用于工藝驗證的生物指示劑的耐熱性。當在滅菌工藝的驗證中使用低D值的生物指示劑時，SAL在數值上更高，但是不提供與使用更耐熱的生物指示劑一樣高的安全閾值。SAL 應該始終與 D 值相關，D 值高于常規生產中的正常生物負載?！?/em>這里闡述的理念正如日本的生物指示劑和微生物負載結合法所表達的一樣。滅菌條件可以降低，但必須基于科學的態度選擇無菌保證水平最高的方式，并進行嚴格的驗證和生產監控。?
令人遺憾的是，我國監管機構對滅菌工藝選擇上有開倒車的趨勢?！稖缇?無菌工藝驗證指導原則》在2013年和2020年發布了兩版征求意見稿，在2013年版是這樣描述的：“目前濕熱滅菌方法主要有兩種：過度殺滅法（F0≥12）和殘存概率法（8≤F0<12）。用其它F0值小于8的終端滅菌條件的工藝，則應該按照無菌生產工藝要求。”而在2020版，是這樣描述的：“注射劑的濕熱滅菌工藝應首選過度殺滅法，即F0（標準滅菌時間）值大于12的滅菌工藝；對熱不穩定的藥物，可以選擇殘存概率法，即F0值大于8的滅菌工藝。如果F0值不能達到8，提示選擇濕熱滅菌工藝不合適，需要考慮無菌生產工藝。”原先的版本，雖然不向日本和歐盟一樣對于F0值<8的熱處理選擇給出詳細的指導，但也并沒有禁止；新的版本則直接選擇了一刀切。這樣的做法，必然導致一部分注射劑的一致性評價做不下去（如輸液產品原研F0值<8，而國內輸液F0值>8是審評的紅線），更可怕的是引導企業在一致性評價過程中逐漸降低注射劑的無菌保證水平（本可能采用的終端熱處理都成了無菌灌裝），長此以往臨床應用的安全性問題將會逐漸顯現。
希望我國的無菌指南在正式稿頒布時，能夠學習發達國家的做法，更加科學，全面地指導企業研發和生產。
